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猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒（TG102）
详细信息
【产品名称】 探针法 RT-qPCR 试剂
【产品编号】 TG102
【产品规格】 50T/盒，50μL 体系
【预期用途】
本试剂盒内含高效 2×Probe RT-qPCR Buffer 与 RT-PCR Enzyme Mix，结合猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型（NA-PRRSV）病原特异性引物探针（TG102 Oligo Mix）使用，可实现 NA-PRRSV 核酸的快速检测。
【检验原理】
1、本试剂盒通过实时荧光 RT-qPCR 技术，实现核酸靶标的快速精准检测。
2、本试剂盒 RT-PCR 检测体系含有外源性内标，可通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有 PCR 抑制物，避免 PCR 假阴性。
【主要组成成份】
| 组分名称 | 规格与装量 | 主要成分 |
| 2×Probe RT-qPCR Buffer | 1250μL/管 | dNTPs、PCR Buffer |
| RT-PCR Enzyme Mix | 100μL/管 | M-MLV酶、热启动Taq酶等 |
| TG102 Oligo Mix | 650μL/管 | 靶基因引物与探针，内标引物、探针、质粒 |
| TG102 Positive Control | 200μL/管 | 含有NA-PRRSV靶标核酸序列 |
| TG102 Negative Control | 200μL/管 | TE、基质 |
备注：
1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
2）试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。
3）自备试验器材：DNase/RNase-free 处理的 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管（8 联管或 96 孔板）；台式离心机；台式震荡混合器；分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头（10μL，200μL，1000μL）。
【储存条件及有效期】
试剂盒应避光长期保存于-15℃以下，有效期为 12 个月，避免反复冻融；日常使用时可置 2～8℃暂存，时间不超过 7 天。
【适用仪器】
适用于猪警 2000 系列、宏石 Slan-24/48/96 系列、ABI 系列、安捷伦 Mx3000P、Bio-rad CFX 系列等荧光 PCR 仪。
【样本要求】
1、适用样本类型：猪的肺、脾、肾、扁桃体、淋巴结、唾液和血液等样本经提取纯化后的核酸。
2、样本处理：建议使用商业化的试剂盒提取样本中的 RNA。所提取的 RNA 建议立即进行检测，否则请于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过 6 个月。
【检验方法】
1、试剂准备（在试剂准备区进行）
1.1 取出包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后瞬时离心备用。
1.2 按下表比例配制，充分混匀成 PCR-Mix，瞬时离心。
| 组分名称 | μL/单反应 | μL/n*反应 |
| 2×Probe RT-qPCR Buffer | 25 | 25×（n+1） |
| RT-PCR Enzyme Mix | 2 | 2×（n+1） |
| TG102 Oligo Mix | 13 | 13×（n+1） |
*n 为待测样本（含阳性对照与阴性对照）数量。
1.3 将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2、样本处理及加样（在样本处理区进行）
2.1 根据待测样本、Negative Control、Positive Control 的数量准备反应管，向每个反应管加入40μL。
2.2 分别吸取已处理的待测样本 RNA、Negative Control、Positive Control 各 10 μL 加入对应反应管，盖好管盖，转移到扩增区。
3、PCR 扩增（在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1 将 PCR 反应管放入扩增仪，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称。
3.2 荧光检测通道选择：
（1）选择 FAM 通道检测 NA-PRRSV 核酸；
（2）选择 HEX 通道检测内标；
（3）请勿选择 ROX 参比荧光；
（4）设置反应体系为 50 μL。
3.3 循环参数设定：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
| 1 | 逆转录 | 50℃ | 15分钟 | 1 |
| 2 | 预变性、酶激活 | 95℃ | 2分钟 | 1 |
| 3 | 变性 | 95℃ | 15秒 | 45 |
| 退火，延伸及荧光采集 | 60℃ | 30秒 | ||
| 4 | 仪器冷却 | 25℃ | 10秒 | 1 |
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
4、结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置）
4.1 反应结束后自动保存结果，仪器将对结果进行自动分析，给出 Ct 值。注意查看结果的扩增曲线的形状，存在 Ct 值的结果需呈典型曲线。
4.2 用户也可根据实际情况自行调整，基线起点值可以在 3~15、基线终点值可设在 5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。
5、质量控制
5.1 Negative Control：FAM 通道无 Ct 值显示、且 HEX 通道 Ct 值≤35；
5.2 Positive Control：FAM 通道 Ct 值≤30，且具有典型扩增曲线；
5.3 上述要求需同时满足，否则，试验结果无效，需重新进行。
【结果判定】
1、测定 FAM 通道 Ct 值≤40 且具有典型扩增曲线，报告 NA-PRRSV 核酸检测阳性；
2、测定 FAM 通道 Ct 值＞40 或无 Ct 值，且 HEX 通道 Ct 值≤35，报告 NA-PRRSV 核酸检测阴性。
3、测定 FAM 通道 Ct 值＞40 或无 Ct 值，且 HEX 通道 Ct 值> 35 或无 Ct 值显示，则该样本的检测结果判定无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
【检测方法的局限性】
1、样本检测结果与试剂盒运输、样本收集、处理、运送及保存质量有关；
2、如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；
3、阳性对照、扩增产物泄漏，可能导致假阳性结果；
4、病原体流行毒株发生变异，可能导致假阴性结果；
5、不同核酸提取方法存在提取效率差异，可能导致假阴性结果；
6、试剂运输，保存不当或试剂配制不准确，可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性或定量不准确的结果。
【产品性能指标】
1、本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为 100%；
2、精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果 Ct 值的变异系数均<3%；
3、最低检测限：500 copies/mL；
4、特异性试验表明与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。
【注意事项】
1、本试剂盒仅做科研使用，结果仅做诊断参考，使用前请仔细阅读本说明书。
2、实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3、实验室管理应严格按照 PCR 基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4、所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
5、出现无法按照说明书判定的情况，请联系公司技术支持。